Department Environmental Toxicology

Wastewater treatment plant (WWTP) effluents are major sources of endocrine disrupting chemicals (EDCs) and of other chemicals of toxicological concern for the aquatic environment. In this study, we used an integrated strategy combining passive sampling (Chemcatcher^®), developmental toxicity and mechanism‐based in vitro and in vivo bioassays to monitor the impacts of a WWTP on a river. In vitro screening revealed the WWTP effluent as a source of estrogen (ER), glucocorticoid (GR), aryl hydrocarbon (AhR) receptor mediated activities, impacting the downstream river site where significant activities were also measured, albeit to a lesser extent than in the effluent. Effect‐directed analysis (EDA) of the effluent successfully identified the presence of potent estrogens (estrone, 17α‐ethinylestradiol and 17β‐estradiol) and glucocorticoids (clobetasol propionate and fluticasone propionate) as the major contributors to the observed in vitro activities, even though other unidentified active chemicals were likely present. The impact of the WWTP was also assessed using zebrafish embryo assays, highlighting its ability to induce estrogenic response through up‐regulation of aromatase promoter‐dependent reporter gene in the transgenic (cyp19a1b–GFP) zebrafish assay and to generate teratogenic effects at non‐lethal concentrations in the zebrafish embryo toxicity test. This study argues for the use of such an integrated approach, combining passive sampling, bioassays and EDA, to comprehensively identify endocrine active compounds and associated hazards of WTTP effluents.

Die Identifizierung und Überwachung von Chemikalieneffekten auf Organismen in der Umwelt beruht auf einem breiten Spektrum von Herangehensweisen und Messpunkten. Allerdings wurden bisher viele der existierenden Untersuchungsmethoden lediglich für wenige Modellorganismen entwickelt. Die Berücksichtigung der Artenvielfalt und der Vielfalt an Reaktionen auf Umweltstressoren ist daher nach wie vor eine grosse Herausforderung. Die Analyse von messengerRNA (mRNA), welche für ausgewählte Biomarkermoleküle kodieren, ist dagegen ein vielversprechender Ansatz, da er auf ein weites Spektrum an Organismen und biologische Antworten übertragbar ist.
In diesem Projekt sollten die Einflüsse von Mikroschadstoffeintrag von Abwässern auf Flussökosysteme untersucht werden. Es wurde ein Biomarker-Genset für die Bachforelle (Salmo trutta) und die Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) etabliert, um die Wirkung von Mikroschadstoffen, wie Pharmaka und Pestizide, im Fisch nachweisen zu können. Ein typisches Biomarker-Set besteht aus 20-25 spezifischen Genen, welche verschiedene zelluläre Stressantworten, wie allgemeinen Stress, Metall- und oxidativen Stress, Biotransformation, Immunregulation usw. reflektieren. Die Regulation dieser Gene wurde in Leber und Nierengewebe in Bachforellen analysiert, welche ober- und unterströmig von vier verschieden Abwasserreinigungsanlagen (ARA) gefangen wurden. Zwei Standorte wurden doppelt untersucht: Herisau (Appenzell) vor und nach der Aufschaltung der Pulveraktivkohle (PAK)- Abwasserreinigungs-einheit und Steinach (St. Gallen) vor und nach dem Stopp der Abwassereinleitung. An diesen Standorten sollte überprüft werden ob mit dieser Methode Veränderungen der Wasserqualität und der Effekte auf die Fische erfasst werden können. Die Daten zeigen, dass die mRNA Regulation standortspezifisch ist. Fische, welche Unterhalb der Kläranalagen gefangen wurden, zeigen eine erhöhte Stressantwort an. Zudem konnten wir aufgrund der Genexpression das Einwirken von spezifischen Gruppen von Chemikalien identifizieren, wie Schwermetalle, endokrine Disruptoren, Pharmaka oder Pestizide. Tatsächlich bestätigte die chemische Analytik das Vorhandensein solcher Chemikalien im Wasser an den Probenahmestandorten. Ebenfalls konnten positive Effekte auf die Wasserqualität durch die Umbauten der ARAs in Herisau und Steinach mittels Genexpressionsanalyse in den untersuchten Fischen bestätigt werden.
Im Projekt ReTREAT auf der ARA Neugut wurden verschiedene Nachbehandlungen, im Anschluss an die Ozonung von Abwasser, auf deren Leistungsfähigkeit untersucht, toxische Transformations- oder Oxidationsnebenprodukte zu reduzieren. Zur Erfassung der ökotoxikologischen Wirkung wurden zahlreiche Biotests durchgeführt, darunter auch ein Fish Early Life Stage-Test (FELST) mit Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss). Als Ergänzung zu den Standardendpunkten dieses Tests wurden normalerweise nicht erfassbare subletale Effekte mittels einem spezifischen Biomarker-Genset untersucht. Die Ergebnisse bestätigen die Effizienz der Ozonung, organische Mikroverunreinigungen aus dem Abwasser zu eliminieren und hervorgerufene subletale Effekte auf die Fische zu verringern. In Übereinstimmung mit den meisten anderen Tests konnte die gute Eignung der Nachbehandlung des ozonierten Abwassers durch den frischen Aktivkohlefilter (GAK2) bestätigt werden.
Im Projekt ReTREAT auf der ARA Neugut wurden verschiedene Nachbehandlungen, im Anschluss an die Ozonung von Abwasser, auf deren Leistungsfähigkeit untersucht, toxische Transformations- oder Oxidationsnebenprodukte zu reduzieren. Zur Erfassung der ökotoxikologischen Wirkung wurden zahlreiche Biotests durchgeführt, darunter auch ein Fish Early Life Stage-Test (FELST) mit Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss). Als Ergänzung zu den Standardendpunkten dieses Tests wurden normalerweise nicht erfassbare subletale Effekte mittels einem spezifischen Biomarker-Genset untersucht. Die Ergebnisse bestätigen die Effizi-enz der Ozonung, organische Mikroverunreinigungen aus dem Abwasser zu eliminieren und hervorgerufene subletale Effekte auf die Fische zu verringern. In Übereinstimmung mit den meisten anderen Tests konnte die gute Eignung der Nachbehandlung des ozonierten Abwassers durch den frischen Aktivkohlefilter (GAK2) bestätigt werden.
Damit ist dies eine vielversprechende Methode für die Überwachung der Wasserqualität und der Fischgesundheit. Die Biomarker-Gensets sind sehr flexibel; weitere Anpassung für spezifische Effektmessungen, Übertragung auf andere Fischarten sowie weitere Anwendungen sind möglich.
Zudem wird versucht das Umweltmonitoring auf etablierte Zelllinien vom Fisch zu erweitern, welche eine tierfreie Alternative für die Umweltüberwachung darstellen könnten. Dabei werden permanente Zelllinien der Regenbogenforelle eingesetzt. Diese werden direkt im Labor mit Wasserproben, die an den Feldstandorten gewonnen wurden, exponiert. Die danach in diesen Zellen gemessene Expression wurde mit der Genexpression von im Fluss gefangenen Fischen und der chemischen Analytik verglichen. Stimmen die biologischen Antworten überein, könnten die Fischzellen zukünftig die Umweltüberwachung "übernehmen". Bisher konnte eine gute Übereinstimmung mit einigen Markergenen gefunden werden.

The implementation of targeted and nontargeted chemical screening analysis in combination with in vitro and organism-level bioassays is a prerequisite for a more holistic monitoring of water quality in the future. For chemical analysis, little or no sample enrichment is often sufficient, while bioanalysis often requires larger sample volumes at a certain enrichment factor for conducting comprehensive bioassays on different endpoints or further effect-directed analysis (EDA). To avoid logistic and technical issues related to the storage and transport of large volumes of water, sampling would benefit greatly from onsite extraction. This study presents a novel onsite large volume solid phase extraction (LVSPE) device tailored to fulfill the requirements for the successful effect-based and chemical screening of water resources and complies with available international standards for automated sampling devices. Laboratory recovery experiments using 251 organic compounds in the log D range from−3.6 to 9.4 (at pH 7.0) spiked into pristine water resulted in acceptable recoveries and from 60 to 123% for 159 out of 251 substances. Within a European-wide demonstration program, the LVSPE was able to enrich compounds in concentration ranges over three orders of magnitude (1 ng L⁻¹ to 2400 ng L⁻¹). It was possible to discriminate responsive samples from samples with no or only low effects in a set of six different bioassays (i.e. acetylcholinesterase and algal growth inhibition, androgenicity, estrogenicity, fish embryo toxicity, glucocorticoid activity). The LVSPE thus proved applicable for onsite extraction of sufficient amounts of water to investigate water quality thoroughly by means of chemical analysis and effect-based tools without the common limitations due to small sample volumes.

Im Projekt EcoImpact wurden die ökotoxikologischen und ökologischen Effekte von Mikroverunreinigungen aus Kläranlagen auf aquatische Lebensgemeinschaften untersucht. Chemische und biologische Untersuchungen oberhalb und unterhalb von Kläranlagen deuten auf Effekte dieser Stoffe hin, die von physiologischen Antworten der Organismen bis hin zu veränderten Ökosystemfunktionen wie z. B. dem Laubabbau reichen. Gezielte Rinnenexperimente mit kontrollierter Wasserqualität unterstützen diese Befunde.

The aim of the research was to explore the contribution of hepatic cytochrome CYP1A and metallothionein (MT) mRNA expression to biological effect monitoring. The study was conducted in the European flounder (Platichthys flesus) from the Gulf of Gdańsk. mRNA abundance was measured using reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) in liver RNA of fish sampled from three coastal stations and from one offshore station in the inner Gulf. The contribution of the mRNA-based biomarkers to the assessment of the environment was determined in conjunction with a selection of commonly applied biochemical markers: 7-ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD), glutathione-S-transferase (GST), catalase (CAT), metallothioneins (MT), fluorescent aromatic compounds (FACs), all measured in the same individual fish. The mRNA biomarkers contributed to the separation between the sampling sites, but no correlations between CYP1A mRNA and EROD nor between MT mRNA and MT proteins were found, which should be attributed to the different levels these biomarkers correspond to and to the differences in factors that may affect them. One case of strong correlation between CYP1A mRNA and FACs was encountered. The overall results of this study suggest that biomarkers measured at the mRNA abundance level constitute a valuable addition to biomonitoring studies by providing additional information and contributing to the differentiation of results.

Proteomics approaches are being increasingly applied in ecotoxicology on the premise that the identification of specific protein expression changes in response to a particular chemical would allow elucidation of the underlying molecular pathways leading to an adverse effect. This in turn is expected to promote the development of focused testing strategies for specific groups of toxicants. Although both gel-based and gel-free global characterization techniques provide limited proteome coverage, the conclusions regarding the cellular processes affected are still being drawn based on the few changes detected. To investigate how specific the detected responses are, we analyzed a set of studies that characterized proteome alterations induced by various physiological, chemical and biological stressors in zebrafish, a popular model organism. Our analysis highlights several proteins and protein groups, including heat shock and oxidative stress defense proteins, energy metabolism enzymes and cytoskeletal proteins, to be most frequently identified as responding to diverse stressors. In contrast, other potentially more specifically responding protein groups are detected much less frequently. Thus, zebrafish proteome responses to stress reported by different studies appear to depend mostly on the level of stress rather than on the specific stressor itself. This suggests that the most broadly used current proteomics technologies do not provide sufficient proteome coverage to allow in-depth investigation of specific mechanisms of toxicant action. We suggest that the results of any differential proteomics experiment performed with zebrafish should be interpreted keeping in mind the list of the most frequent responders that we have identified. Similar reservations should apply to any other species where proteome responses are analyzed by global proteomics methods. Careful consideration of the reliability and significance of observed changes is necessary in order not to over-interpret the experimental results and to prevent the proliferation of false positive linkages between the chemical and the cellular functions it perturbs. We further discuss the implications of the identified "top lists" of frequently responding proteins and protein families, and suggest further directions for proteomics research in ecotoxicology. Apart from improving the proteome coverage, further research should focus on defining the significance of the observed stress response patterns for organism phenotypes and on searching for common upstream regulators that can be targeted by specific assays.